图 2 Cre依赖的内质网表达TurboID

作者分别选用了21种不同组织特异性Cre成年小鼠（例如骨骼肌、脂肪细胞、肝细胞、心脏等），采用尾静脉注射AAV9-ER-TurboID的方法分别在各组织细胞内质网中表达了TurboID。病毒注射三周后，小鼠进行每天1小时，20 m/min的跑步机训练，持续一周。在训练第四天时开始通过饮用水和腹腔注射的方式补充生物素，第七天训练结束后颌静脉取血，利用链霉亲和素对血浆中的生物素化蛋白纯化后，检测蛋白质的种类。为了确定跑步机训练实现小鼠运动的目的，在小鼠七天跑步机训练后，作者检测到已知的和运动相关基因表达量上调（Pgc1a、Nr41a）、脂肪重量减少、脂肪细胞面积减小，但是摄食基本不变。作者共检测到了1272个细胞类型-蛋白对（每种细胞所分泌的每种蛋白都视为一个独立的样本），181个变化的分泌蛋白质。其中肝细胞和肌肉细胞分泌蛋白种类最多，但是运动前后脂肪肝细胞（Pdgfra+）分泌蛋白变化数量最多。。

经过7天训练，分泌量仅在一种细胞组织中发生变化的蛋白有129种，分泌量在多种细胞组织中发生变化的蛋白有52种。例如LOXL1在所有细胞类型中分泌量都下调；EMIL1在所有细胞类型中分泌量都上调；SOD3和HSP7C存在双向调节，在一些细胞类型中上调，另一些细胞类型中下调。这些数据中作者发现了很多以前未发现的运动调节的分泌蛋白，并对这些分泌蛋白的细胞来源提供了依据。

由于运动前后分泌量蛋白变化数量最多的细胞是脂肪干细胞，作者对运动诱导的脂肪干细胞分泌组进行了GO分析。发现这些变化的分泌蛋白主要参与了“刺激响应”。为了探究这些运动诱导的分泌蛋白是否和运动持续时间相关，作者分别设置了不运动、运动1天、运动3天以及运动7天的Pdgfra-Cre小鼠，检测脂肪干细胞分泌蛋白中F13A、C4BPA和ITIH2的表达量。发现ITIH2在运动后第1天分泌量就增加并持续稳定；C4BPA分泌量在运动1-3天降低，第7天又增加；F13A分泌量在第1天增加，第3天降低，第7天又增加。说明脂肪干细胞对运动的响应具有多样性，并且部分蛋白的分泌依赖于运动时间。

在对肝细胞分泌组进行分析时，作者发现了一组主要催化酯键水解的同工酶CES2A/C在运动后上调。CES2主要在肝脏细胞表达，通过N端HXEL序列结合KDEL序列定位于内质网。CES2被认为在含酯异生物质代谢中发挥重要作用，例如抗抑郁药物伊立替康、阿片类药物等，同时还能水解甘油三酯和甘油二酯促进脂肪代谢。文献显示肝脏细胞过表达CES2可以降低小鼠体重，但是作者在血浆中检测到了肝细胞分泌的CES2，因此作者想知道这些肝细胞分泌到血液中的CES2发挥什么样的作用。

首先作者想知道被认为定位于肝细胞内质网的CES2如何在运动后分泌到胞外。运动后肌肉产生大量的乳酸，但是无法利用，大量乳酸分泌到胞外，通过血液运输到肝脏细胞，再由肝细胞通过糖异生合成葡萄糖后运输到肌肉组织供其利用。作者想知道乳酸是否会促进肝细胞CES2的分泌，于是做了一个体外细胞实验，发现乳酸进入肝细胞后促进CES2通过经典的内质网-高尔基体-囊泡分泌途径运输到胞外。

接着作者想知道肝细胞分泌到胞外的CES2是否以及如何参与降低体重的过程。他们构建了CES2 HXEL序列突变病毒AAV8-Tbg-CES2-ΔC，并将其注射到小鼠体内，使CES2在肝细胞特异启动子Tbg调控下表达并分泌胞外。发现在肝细胞过表达分泌性CES2A/C后小鼠体重下降、血糖浓度更低、白色脂肪减少，但是其他组织没有明显变化。于是作者检测了代谢变化，发现肝细胞过表达分泌性CES2A/C后小鼠氧气消耗量增加，且CES2A可以促进小鼠的运动。作者还通过突变掉酶活性位点证明了肝细胞分泌到胞外的CES2的整体作用需要其羧酸酯酶活性，非靶向代谢组学分析提示CES2C可能更倾向于通过脂质代谢促进体重降低。

总之，本文利用定位于内质网的TurboID研究了多种组织和细胞分泌蛋白在运动后的变化，发现了很多新的响应运动的细胞类型分泌蛋白。他们发现运动产生的乳酸进入肝细胞，协助CES2A和CES2C分泌到胞外，并且探索胞外CES2在降低肥胖中的潜在机制（抗肥胖、增强葡萄糖耐受等），为日后研究细胞-细胞间相互作用提供了新思路。