撰文｜黄旭颖（2023级博士研究生）
审稿｜张昱
背景介绍
重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是一种由自身抗体引起的慢性自身免疫病，其发病机理为自身抗体结合神经肌肉信号传导所需的关键蛋白导致信号传导中断。在正常情况下，肌肉细胞会表达跨膜蛋白MuSK（Muscle-specific tyrosine kinase）、LRP4（LDL receptor related protein 4），当有肌肉运动相关信号传导过来时，运动神经元会产生神经元蛋白聚糖Agrin，Agrin/MuSK/LRP4形成复合体，使下游一系列蛋白发生磷酸化，原本松散的AChR（acetylcholine receptor）形成AChR clustering，完成神经肌肉接头的突触信号传递。
肌肉特异性酪氨酸激酶重症肌无力（Muscle-specific tyrosine kinase myasthenia gravis， MuSK MG）是MG的一种，其特征为患者体内B细胞来源的浆细胞产生anti-Musk的自身抗体，这些自身抗体靶向MuSK会破坏神经肌肉结合信号，影响信号传递，从而产生肌无力症状。
目前MuSK MG患者主要的治疗手段（糖皮质激素、硫唑嘌呤、血浆置换、anti-CD20单抗、anti-CD19 CAR-T）虽有一定疗效，但会抑制所有B细胞，减低体内总的IgG，造成免疫抑制。理想的治疗方式应该是仅消除致病性anti-MuSK B细胞，保留健康B细胞，从而实现持续的肌无力症状减退。
因此宾夕法尼亚大学的Aimee S. Payne和Samik Basu课题组设计了一种工程化的T细胞（MuSK-CAART），嵌合了自身MuSK抗体的受体，精准靶向表达anti-MuSK自身抗体的B细胞而不损害其他B细胞。
图1：（左）总的MuSK CAAR的结构示意图，（右）四个不同domain的MuSK CAAR的结构示意图
作者设计的MuSK-CAAR包含了完整的MuSK胞外域，将其与CD137-CD3ζ共刺激和激活结构域连接起来（图1），并验证了其在人类T细胞中的表达。
根据作者提供的CAAR结构，我以表面表达anti-Ig1抗体的B细胞为例，绘制了一个MuSK CAART特异性杀伤anti-Ig1 B细胞的示意图（图2），同理，MuSK CAART因为携带了不同的MuSK胞外结构域（Ig1/Ig2/Ig3/Fz），因此可以特异性识别并杀伤产生四种不同MuSK抗体的B细胞。
图2：MuSK CAAR-T细胞特异性杀伤产生Anti-MuSK Ig1抗体的B细胞的示意图
研究结论
1. MuSK-CAAR特异性靶向疾病相关的抗MuSK B细胞表位
为验证MuSK-CAART的细胞毒性，作者从MuSK MG病人或MuSK免疫小鼠中分离出BCRs序列，构建了四种表达不同的anti-MuSK domain BCR（anti-Ig1/Ig2/Ig3/Fz）的Nalm-6（人的B淋巴细胞白血病细胞）靶细胞，将T细胞与靶细胞共培养，他们发现MuSK-CAART可以特异性裂解表达每个不同的MuSK结构域的Nalm-6细胞，但不裂解对照的Nalm-6细胞（c–g）。共培养24小时比共培养5小时特异性细胞毒性增加。在MuSK-CAART与anti-MuSK Nalm-6共培养的上清液中检测到IFNγ，但对照组未检测到IFNγ （h）。因此证明MuSK-CAART能对有着不同MuSK domain的细胞呈现出特异的细胞毒性。
2. 可溶性anti-MuSK抗体存在影响MuSK-CAART的增殖、细胞毒性以及IFNγ产生
生理情况下，人体内还会存在可溶性抗体，它们可能会阻断MuSK-CAART与anti-MuSK BCR的结合，但也可能激活MuSK-CAART增强他们的细胞毒性。
为检测可溶性anti-MuSK抗体对MuSK-CAART活性的影响，作者从两个MuSK MG患者（MG3/MG5）的血清中纯化了IgG，并在IgG的生理浓度范围内进行了细胞毒性试验，将MuSK-CAART分别与不同BCR的Nalm-6靶细胞和相匹配的anti-MuSK的抗体进行共培养，发现细胞毒性能够被患者的IgG部分抑制，这说明可溶性抗体在一定程度上可能会阻断MuSK-CAART与anti-MuSK BCR的结合，但这种阻断作用普遍能够随着效靶比的增加和共培养时间的延长而被削弱。
此外，anti-MuSK antibodies本身也能够直接刺激MuSK CAART产生IFNγ并增殖，且该作用与抗体浓度正相关。作者也评估了抗体所介导的MuSK CAART对其他表达Fc受体细胞（单核细胞、NK细胞）的间接杀伤作用，发现MuSK CAART并未间接杀伤这些细胞。
以上关于可溶性anti-MuSK抗体的作用，作者在文中并未给出直接结论，但我们可以看到在体外实验中，可溶性anti-MuSK抗体虽然有潜在的阻断MuSK-CAART与anti-MuSK BCR的结合的作用，但这种阻断作用可以通过优化培养条件来改善，且可溶性抗体具有明显的激活MuSK-CAART增强细胞毒性的效果。
3. 体内实验中，MuSK-CAART通过BCR靶向anti-MuSK B细胞产生的效果与anti-CD19 CART介导的细胞毒性相当
接下来作者在体内评估了MuSK CAART消除anti-MuSK B细胞的能力是否与anti-CD19 CART相当，作者构建了移植Nalm6 target细胞的NSG（一种重度免疫缺陷小鼠，多用于人源细胞或组织移植）小鼠模型。MuSK CAART治疗后的小鼠体内，Nalm6 target细胞生长受到抑制，效果与anti-CD19 CART治疗组相似。同时，比较治疗后从脾脏中分离出的T细胞后发现：MuSK-CAAR的表达保持稳定，而anti-CD19 CAR的表达较输注的T细胞明显降低。
以上说明MuSK-CAART靶向anti-MuSK BCR的能力与anti-CD19 CART相近，MuSK CAART细胞在体内驻留的时间甚至可能长于anti-CD19 CART。
4. 在EAMG小鼠模型中，MuSK-CAART降低Anti-MuSK的IgG，但不降低总的IgG
为了模拟人体内免疫健全的生理环境，作者用人的MuSK蛋白免疫小鼠，诱导产生实验性的自身免疫重症肌无力（experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG）小鼠模型，并验证MuSK-CAART的作用，结果表明：接受MuSK CAART治疗后的小鼠体内仍然能检测到一定水平的B细胞，而接受了anti-CD19 CART治疗的小鼠其脾脏和淋巴结中的B细胞几乎被完全清除；此外，MuSK-CAART治疗后降低了MuSK EAMG小鼠体内的anti-MuSK的IgG，但不降低血清中总的IgG。这些结果表明在具有免疫活性的小鼠体内，MuSK CAART可以特异性清除抗原特异性的B细胞并不会清除其他健康B细胞。
5. MuSK CAART并未观察到明显的脱靶毒性
最后，作者在文中使用了多种技术手段较为详细地评估了MuSK-CAART的潜在脱靶毒性，包括小鼠的器官组织病理学分析、高通量的人细胞表面膜蛋白阵列筛选，人原代细胞的毒性筛选以及基于MuSK互作蛋白的肌肉毒性研究均未观察到脱靶毒性。
总结
综上，该篇文章介绍了一种治疗MuSK重症肌无力的新方法—MuSK-CAART，在小鼠模型中取得了较好的效果，该工程化的MuSK-CAART 细胞只对产生anti-MuSK自身抗体或表达anti-MuSK BCR的B细胞具有细胞毒性，并不降低血清中总的IgG，即使在可溶性anti-MuSK抗体存在的情况下仍有较好的细胞毒性，能够避免现有疗法由于清除所有B细胞所带来的免疫抑制。
虽然作者提出了一种新的MuSK CAART的细胞治疗方法，但实验设计上仍有一些不够完善的地方，包括以下几个方面：
1. 缺乏对照组：Figure 2a 缺乏正常人的IgG对照，Figure 6b缺乏没有经过处理的T细胞对照；
2. 图标指示不清：Figure 5b CART-19处理过的小鼠肺部HE染色黑色箭头所指示的部位并不是局灶血栓；
3. 并没有构建真正的疾病模型：文中构建的EAMG小鼠模型，仅仅是体内具有小鼠的anti-MuSK B细胞和anti-MuSK IgG抗体的模型，缺乏MG表型；
4. 缺乏示意图：由于文章涉及到多种不同的细胞处理以及两种不同的小鼠模型，如果每一个Figure均有一个流程图，对于读者理解实验会更有帮助，此外，文章如果加上MuSK CAART的结构及其发挥功能的示意图会更直观。
总体来说，作者设计的MuSK CAART不仅可以治疗MuSK MG，对治疗以MuSK MG为代表的其他病因为自身特异性抗体存在的自身免疫性疾病也提供了新的思路。
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