有 70 种神经退行性疾病是由基因特异性串联重复序列的扩增引起的，其中有不少与（CAG）、（CTG）重复序列的扩增有关，这包括亨廷顿病（HD）和脊髓小脑共济失调（SCA）。单链 DNA ( single-stranded DNA，ssDNA )在转录、复制、修复或重组后重新连接时，由于碱基配对错误而形成slipped-CAG DNA结构。单链结合蛋白（SSB，single strand DNA-binding protein）是生命所必需的，普遍表达，几乎介导了所有涉及ssDNA的过程，包括DNA双链的不稳定性、异常DNA结构的解链、DNA的重新接合、ssDNA的保护以及DNA蛋白的招募。人类的主要SSB是经典的 RPA（复制蛋白 A），它是由 RPA1、RPA2 和 RPA3 组成的复合物；灵长类动物还表达另一种形式的RPA，即Alt-RPA，它与经典RPA的区别在于RPA2与RPA4的对映体互换，RPA4与RPA2具有相似的结构域，而RPA4的功能尚不清楚。

图1：经典RPA ( RPA1、2、3)与Alt - RPA ( RPA1、4、3)

 

2023年10月，来自多伦多大学的Christopher Pearson课题组在Cell上发表题为“Antagonistic roles of canonical and alternative-RPA in disease-associated tandem CAG repeat instability”的文章，他们发现，在亨廷顿病和脊髓小脑共济失调 1 型（SCA1）患者大脑中， Alt-RPA浓度上调，在正常情况下RPA能增强体外解链、FAN1切除和slipped-CAG的修复，并能防止人类细胞中的CAG重复序列扩增。在SCA1小鼠大脑中过表达RPA可消除扩增，同时减少ATXN1聚集、减少大脑DNA损伤、改善神经元形态并修复运动表型。相反，Alt-RPA可抑制解链、FAN1 切除和slipped-CAG的修复，并促进CAG重复序列扩增。这些发现表明这两种RPA之间存在功能性相互作用，Alt-RPA可拮抗RPA，从而加强对疾病相关CAG重复序列的扩增作用，并可扩展到其他DNA过程。

 

为了研究这一差异，研究人员首先对HD和SCA1患者死后大脑中RPA亚基的RNA和蛋白质水平进行了定量分析，发现在纹状体内和小脑，与未受影响的个体相比，HD 患者的所有 RPA 转录物均显著上调。

 

接下来他们构建了两种环状(CAG)50·(CTG)30 slipped-DNA底物，进行体外DNA修复实验，两种底物分别是在重复序列（nick-in-repeat）或侧翼序列（nick-in-flank）中带有缺口，实验发现nick-in-repeat会产生一种迁移缓慢的结构构象，这是slipped-DNA构相改变所导致的，并且加入RPA和Alt-RPA后这种中间体减弱了，研究结果表明，RPA和Alt-RPA都不是形成改变的slipped-DNA构象或修复slipped-DNA的必要条件。然而，以浓度敏感的方式，RPA会竞争性地减少改变的构象并增强slip-out修复，而高水平的Alt-RPA会竞争性地逐渐抑制slip-out修复。

 

为了了解修复效率的差异，研究人员通过电泳迁移试验（EMSA），使用放射性标记的线性化nick-in-repeat slipped-CAG底物，研究RPA和Alt-RPA的DNA结合情况，发现RPA和Alt-RPA均与DNA结合， RPA产生两种不同的迁移较慢的蛋白- DNA复合物，Alt-RPA只产生一个蛋白- DNA复合物，且Alt-RPA结合和解链部分双链DNA结构都比经典RPA慢。有趣的是，RPA能够增强FAN1核酸内切酶活性，而Alt-RPA会抑制FAN1核酸内切酶活性。

 

为了鉴定RPA和Alt-RPA的蛋白-蛋白关联，研究人员使用BioID邻近标记实验鉴定RPA1-4的近端关联蛋白，结果显示互作组相当广泛，包括：CAG不稳定修饰因子( MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、XPG等)；HD/SCA疾病修饰因子( HTT、RM2B/p53R2、UBR5、TCERG1/CA150、SETD2/HYPB/KMT3A等)； CAG/CTG疾病发病机制相关；其他重复扩展病相关蛋白(RFC1、ATXN2、ATXN10、EIF4A3、DIP2B等)； DNA损伤应答( P53、MRE11、NBN、LIG3、BRCA1、BRCA2、XPC等)；染色质生物学；DNA/RNA代谢；DNA损伤等相关蛋白。且使用纯化的RPA和Alt-RPA复合物与MutSα(MSH2-MSH6)和MutSβ(MSH2-MSH3)蛋白复合物进行免疫共沉淀实验也支持BioID结果，即Alt -RPA与MutSβ相互作用，RPA与MutSα、MutL和HTT相互作用。而在过表达了人RPA2或RPA4的HT1080细胞模型中，发现RPA上调抑制体细胞CAG重复序列的扩增，Alt-RPA上调促进体细胞CAG重复序列的扩增。

 

为了评估RPA调节的体内效应，研究人员在突变型 Ataxin-1 Q135 knock in SCA1小鼠的大脑中过表达了RPA1，这些小鼠反映了 SCA1 患者的疾病特征，发现RPA上调可以降低基因组范围的DNA损伤和突变型ATXN1累积。

 

图2：Alt – RPA与RPA拮抗互作在体细胞CAG重复序列扩增中的工作模式

 

以上结论揭示RPA防止体细胞CAG重复序列扩增，从而减少疾病表型，而Alt-RPA减少RPA的活性，促进扩增和恶化表型，模型如图2。重复扩增突变涉及单链DNA中间体和异常DNA结构，需要SSB来稳定、保护、解链和退火单链，并招募DNA修复蛋白。经典RPA可通过快速解链slip-outs、加强FAN1介导的slip-outs切除、减少CAG重复序列扩增和减少下游事件来提高正确修复率；Alt-RPA抑制修复、低效解链slip-out和抑制FAN1介导的切除，从而导致扩增并加剧下游事件（本研究显示的下游事件包括脑DNA 损伤和神经元多聚谷氨酰胺聚集体、运动表型、神经元形态以及转录组、剪接体和细胞周期失调）。在非疾病状态下，上层途径可能占主导地位，而在疾病状态下（RPA/Alt-RPA 水平失调），下层途径可能占主导地位。RPA/Alt-RPA 与已知可调节重复扩增的DNA修复蛋白的不同关联也会导致不稳定性。RPA优先与 MutSα（MSH2-MSH6）和MutLβ（MLH1-PMS1）相互作用。Alt-RPA 优先与 MutSβ（MSH2-MSH3）和 XPG 相互作用。

 

总的来说，这项研究揭示了单链DNA结合蛋白RPA和Alt-RPA在表达、功能和蛋白-蛋白互作上的平衡调控与神经退行性疾病相关的体细胞CAG重复序列扩增，对于干预相关神经退行性疾病具有重要意义。

 

但文章仍存在不足，主要问题在于：

 

1. 在突变型 Ataxin-1 Q135 knock in SCA1小鼠的大脑中过表达了RPA1后，为什么RPA1的过表达会同时引起RPA2、RPA3的表达上调？

 

2. 经典RPA与Alt-RPA差异在于异源三聚体组成不同，为什么不在小鼠模型里分别表达RPA4和RPA2或测证是RPA4引起了CAG重复序列的扩增？