在自身免疫性疾病、慢性感染、移植排斥和癌症中，科学家们在遭受慢性炎症和抗原持久阳性的组织中发现了三级淋巴结构 (TLS，Tertiary lymphoid structures)，最近的一些实验探究发现肿瘤内 TLS 的存在和其数量、密度与多种癌症类型的肿瘤免疫治疗良好预后有较高的相关性。

是在成纤维细胞网络上形成的有组织的淋巴样聚集体，主要含有 B 细胞、滤泡树突状细胞、T 细胞、成纤维网状细胞、基质细胞、树突细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和内皮细胞。TLS 包含两个重要的结构区域，一个是T细胞区和B细胞区，成熟的TLS被定义为存在生发中心 (GC，Germinal centre)，GC内含有 T 滤泡辅助细胞和滤泡状树突细胞与B细胞紧密相连，GC 的主要功能是产生记忆B细胞和分泌高亲和力抗体的浆细胞(PC，Plasma cell)。

越来越多的证据表示，成熟的 TLS 与肝细胞癌、肺鳞状细胞癌、结直肠癌和胰腺癌等癌症的免疫治疗效果和生存期密切相关。B 细胞和成熟 TLS 的存在比 T 细胞能更准确地预测病人对免疫检查点抑制剂 (ICI) 的治疗反应和存活率。但是 B 细胞和 PC 对临床结果的影响和对 ICI 反应机制其实目前并不清楚，虽然一些研究显示肿瘤微环境内的 B 细胞可以在某些癌症中产生针对肿瘤抗原的 IgG 或 IgA 特异性抗体，但目前还没有证据表明它们起源于肿瘤内并且 B 细胞可以在 TLS 内发生分化。

作为全球首篇使用 FFPE（formalin fixation and paraffin embedding）空间转录组技术的文章，科学家们在文章中研究了 TLS 作为 B 细胞原位成熟驱动因素、浆细胞的作用以及它们和肿瘤免疫治疗预后的相关性问题。探究了原发性透明细胞肾细胞癌 (ccRCC) 和肿瘤微环境 (TME)的空间关系，分析证明了 B 细胞的体细胞超突变、克隆选择和扩增，以及 PC 产生的免疫球蛋白分布，证明肿瘤内部产生了完整的 B 细胞反应。科学家们还发现 IgG 和 IgA 阳性的 PC 沿着 CXCL12 阳性的成纤维细胞的延伸轨迹迁移。抗体 IgG 与肿瘤细胞结合并且这一现象和肿瘤凋亡有关，因为在 IgG 染色阳性的肿瘤细胞附近通过免疫荧光能检测到 caspase3 阳性的活化的巨噬细胞。最后，研究者们通过统计学分析发现，具有大量 IgG 阳性肿瘤细胞的患者对 ICI 反应表现出高反应率和有更长的生存期。

作者利用10X Genomics Visium 空间转录组学技术对冷冻切片（n = 12）和 石蜡切片（n = 12）共 24 个 ccRCC 原发性肿瘤进行空间转录组学的探究，资深的病理学家根据这 24 个样本的 H&E 染色后的整体组织以及 其TLS 的存在和定位进行了注释，同时应用(MCP)-counter进行机器学习，评估 TME 的 8 种免疫细胞和 2 种基质细胞群的分布，从转录组谱估计细胞类型丰度。对于两种处理的样本的结果解读一致性和相关性比较高，证实了 TLS 与 B 细胞、T 细胞和成纤维细胞特征的表达有关。

为了确定 TLS 在肿瘤中的转录组学特征，科学家们在连续的冷冻切片上使用三种荧光标记 (CD20/CD3/PD1) 来确定 TLS 位置，同时使用 IHC 对 FFPE 样品进行标记(CD3/CD20)，两种切片的结果类似并发现，科学家在 TLS 区域中发现 MZB1 的高表达，同时也在TLS 外部发现够表达区域，因此表明 MZB1 阳性的 PC 可能不仅存在于 TLS 中，而且存在于肿瘤区域中。由于 PC 的主要功能是产生抗体，于是他们又分析了免疫球蛋白基因的空间表达，对 B 细胞，泛 Ig 基因和胶原蛋白基因的分析进一步验证在 TLS+ 肿瘤中，表达 IGHG1 和 IGHA1 的 PC 可能与成纤维细胞的分布有相关性。

TLS 中 B 细胞成熟亚型和 PC 的共定位暗示了原位 B 细胞适应性免疫的产生。在此过程中，B 细胞会突变其 B 细胞受体 (BCR) 序列，并选择和表达高亲和力抗体的克隆。为了验证此过程，作者基于 Visium 冰冻切片空间技术芯片中不同 spot 点位上 Bracode 的RNA测序查询原始转录产物，同时结合免疫组库的单细胞BCR 的测序结果，从中分析 IgL 和 IgH 克隆型及其超突变的程度，发现在肿瘤区域中远离 TLS 的大部分是高度突变的序列。

为了分析肿瘤内 PC 和成纤维细胞的位置以及原位 CXCL12 的表达情况，作者使用 MUM1 和 COL1 对 FFPE 肿瘤切片进行多重免疫荧光标记，在远离 TLS 区域内观察到 COL1+ CXCL12+ 成纤维细胞与 MUM1+ PC 共定位，PC 沿着成纤维细胞轨迹排列，并嵌入在密集的 COL1+ CXCL12+ 成纤维细胞网络中，解释了 PC 在肿瘤中的迁移轨迹。为了定量评估 PC 和成纤维细胞之间的空间关系，作者又对 44 例 DAPI/MUM1/IgG/IgA 免疫荧光染色样品上的成纤维细胞核使用了 AI 检测并进行拟合，用细胞核的映射了 COL1+ 成纤维细胞轨迹，发现绝大多数 PC 与成纤维细胞核非常接近，从另一个维度验证了 PC 和成纤维细胞的空间关系。

为了进一步研究 TLS、肿瘤内 PC 和 Ig 抗体之间的联系，科学家们首先分析了 TLS 成熟度，并研究了 103 个肿瘤中 TLS 的存在与 PC 密度之间的相关性，他们观察到 TLS 的存在与 MUM1+ IgG+ 细胞和 MUM1+ IgA 细胞的密度之间存在显著关联。 进一步研究了 57 个 TLS 阳性样本上 TLS 成熟度标记与 MUM1+IgG+ 和 MUM1+IgA+ PC 密度的相关性。同时为了揭示肿瘤结合 IgG 抗体的潜在功能，分析了肿瘤细胞凋亡特征，结果显示在IgG+肿瘤细胞＞60%的样本中，Caspase 3活化的肿瘤细胞密度显著升高。CD68+巨噬细胞与IgG+ caspase 3+肿瘤细胞距离更近。为了评估 IgG 肿瘤染色与免疫治疗患者预后的相关性，作者评估了 35 个 Nivolumab 治疗和 16 个Nivolumab+Ipilimumab 联合治疗患者的肿瘤样本，并根据 IgG 的染色程度分成两组。发现无论是单用 Nivolumab 还是联合治疗，肿瘤 IgG 染色高的患者的生存期显著延长。

本文的结果揭示了肾脏肿瘤中TLS的存在以及其与B细胞和浆细胞的关联，揭示它们可能在肿瘤的免疫反应中发挥着重要的作用。这对于理解肾脏肿瘤的免疫环境和免疫治疗的反应机制具有重要意义。通过使用 Visium for FFPE 平台，科学家能够在空间上解析出细胞类型和表达，揭示了前人未发现的在癌组织中 B 细胞对治疗和预后的显著意义，为未来癌症免疫治疗治疗提供了思路，同时为深入研究肿瘤微环境和免疫治疗提供了有力的工具和平台。