撰文︱敬洪阳

责编︱王思珍

肌肉的一张一弛是我们生命必不可少的，几乎每时每刻身体里都有肌肉在收缩。运动的时候需要肌肉收缩，这个好理解，其实睡眠时，也需要肌肉收缩，要不然我们没有办法维持呼吸。控制肌肉收缩的一个重要结构是神经肌肉接头（neuromuscular junction, NMJ），这是运动神经元与骨骼肌纤维之间的一个接点，负责将运动神经的信号传递给肌肉，产生肌肉收缩。NMJ是一个化学突触，神经末梢释放乙酰胆碱（ACh），其作用于肌纤维上的乙酰胆碱受体（AChR），使得肌肉纤维兴奋。NMJ高效的信号传递需要神经末梢和肌肉纤维的高度分化，比如在神经末梢接触到肌肉的地方有高密度的AChR聚集。NMJ发育异常或功能障碍可导致肌无力、呼吸衰竭等疾病。

NMJ的形成需要运动神经元释放的聚集素（agrin），其结合肌纤维膜上LRP4，形成四聚体复合物，进而激活肌肉特异性受体酪氨酸激酶（MuSK），诱导AChR聚集、促进NMJ形成。MuSK下游有两个蛋白对AChR聚集非常重要，一个是接头蛋白Dok7，它与MuSK的结合可以增强MuSK激酶活性，它还与一些下游分子如CRK或CRKL结合，促进AChR聚集。另外一个蛋白质是rapsyn，它是一个经典的支架蛋白，有三个功能域：TPR（Tetratricopeptide Repeats）结构域 ，可以结合许多蛋白质，包括MACF1，β-Catenin, α-actinin，Plectin，HSP90β 和Calpain；coiled-coil（CC）结构域结合AChR的β亚基（β-subunit）；RING结构域和β-dystroglycan结合。

有意思的是rapsyn的RING结构域具有E3泛素连接酶的关键特征，如"C3H2C3"的锌指模体（其中C为半胱氨酸，H为组氨酸）。梅林团队在2016年发现rapsyn具有E3连接酶活性（Li et al., Neuron 2016）。重组rapsyn RING结构域在体外能与E1/E2连接酶共同催化自身泛素化。锌指模体关键位点C366的突变，不仅消除了rapsyn在异源细胞中诱导AChR聚集的能力，也削弱了其对rapsyn缺失小鼠NMJ缺陷的挽救功能。C366A敲入小鼠完全丧失NMJ形成能力。这些结果表明，rapsyn的E3酶活性对形成NMJ十分重要。

然而，rapsyn究竟如何通过E3连接酶活性调控NMJ形成的分子机制仍不清楚。E3连接酶可介导多种修饰，包括泛素化（ubiquitination）、类泛素化（neddylation）和SUMO化（sumoylation）。梅林团队前期研究提示rapsyn可能是一个类泛素化 E3连接酶，通过催化底物蛋白与Nedd8的结合来稳定AChR，介导NMJ组装。但是这个假说没有直接的遗传学证据。

近期，首都医学科学创新中心梅林团队在神经科学会的期刊Journal of Neuroscience上发表文章，试图回答这个问题。文章题目为“Neddylation E1 obligatory subunit Nae1 is critical to neuromuscular junction development and maintenance”。研究发现“Neddylation E1必要亚基Nae1对神经肌肉接头的发育与维持至关重要。

类泛素化与泛素化类似，需要E1激活酶、E2结合酶和E3连接酶（如rapsyn）依次催化完成。E2有多个，如Ubc12、Ubc2F等，都可以与rapsyn结合，靶向E2酶验证类泛素化假说具有技术难度。因此他们选择靶向类泛素化 E1酶，该酶由两个必需亚基Nae1（APP-BP1）和Uba3组成。利用配对盒转录因子7（Pax7）特异驱动的重组酶小鼠，他们敲除小鼠肌肉中Nae1，发现突变小鼠出生后很快会因窒息死亡，NMJ的表型与rapsyn缺失或E3连接酶活性缺失突变体（C366A）相似，包括AChR聚集体数量和面积缩小， AChR密度下降等。此外，突触前神经末梢分支增多，部分末梢甚至延伸至肌肉纤维外周区域，提示突触前-后信号协调异常。

图1：骨骼肌Nae1缺失导致NMJ受损及新生小鼠窒息而亡

突变小鼠在胚胎发育早期（E14），未受神经支配的AChR聚集体数量、大小和密度均显著减少。到了E15.5阶段，神经诱导的AChR聚集体形成也受到抑制，且突触前神经分支异常增多。值得注意的是，尽管E15.5时大部分AChR聚集体仍能被神经末梢覆盖，但到了E17.5和出生后（P0），突变小鼠中出现了大量无AChR聚集体的“裸露”神经末梢，表明类泛素化缺失可能导致突触后结构的维持障碍。

图2：骨骼肌Nae1缺失导致AChR浓度降低，AChR聚集体变小，无AChR 神经末梢增多

电生理记录显示，突变小鼠的肌肉纤维中可记录到自发性微小终板电位（mEPP）的比例显著降低，说明NMJ的数量明显减少，这与AChR聚集体数量下降结果一致。可以检测到的mEPP和终板电位（EPP）的振幅减小，与AChR密度下降的形态学结果一致。然而，mEPP频率未受影响，说明突触前ACh释放功能相对正常。这些结果表明，类泛素化主要通过调控突触后AChR的聚集和稳定性影响NMJ功能。

在遗传学研究中，当两个基因在同一通路中协同作用时，单杂合突变（heterozygous）通常不表现明显表型（因野生型等位基因可补偿），但双杂合突变（double heterozygous）可能因叠加效应导致通路功能不足，从而暴露隐性表型，这种现象称为合成表型（synthetic phenotype）。这个双杂合突变揭示遗传互作是验证基因间功能关联的有效办法，比如，Bmp4-FGF8调控心脏发育，单突变轻度心脏畸形，双杂合后严重畸形。为验证rapsyn与Nae1遗传互作调控NMJ形成，梅林团队构建了Nae1杂合敲除（Pax7-Cre;Nae1f/+）与rapsyn C366A杂合突变（C366A/+）的双杂合小鼠。结果显示，双杂合小鼠表现出单一杂合小鼠中未见的NMJ缺陷，包括AChR聚集体面积减小、神经末梢与AChR聚集体分离以及电生理振幅降低。这一遗传学相互作用强烈支持rapsyn作为类泛素化 E3连接酶的假说，并表明Nae1与rapsyn在同一通路中协同调控NMJ形成。

图3：Pax7-Cre; Nae1f/+; C366A/+双杂合突变损坏NMJ信号传递

课题组进一步在C2C12肌细胞中敲除Nae1，发现AChRα和rapsyn的蛋白半衰期缩短，提示类泛素化可能通过抑制蛋白降解维持二者的稳定性。此外，突变小鼠肌肉中AChR和rapsyn的mRNA水平反而升高，可能是代偿机制的结果，表明类泛素化主要作用于翻译后修饰层面。

图4：文章总结图：Rapsyn作为类泛素化E3连接酶调控神经肌肉接头形成，（左图）野生型小鼠；（中图）肌肉特异性缺失类泛素化必需亚基Nae1的小鼠出生后即死亡，并伴随严重神经肌肉接头缺陷；（右图）Nae1与E3连接酶活性缺失突变体C366A的双杂合突变导致相似表型。虚线箭头表示类泛素化缺失，细箭头表示类泛素化减弱。